Трансплантация эмбрионов-2019: 3. Другие животные, статистика и новости из Нанты

В первой части обзора [1] мы знакомили читателя с итогами трансплантации эмбрионов (ТЭ) в России-2019 и опубликованными итогами европейской и мировой ТЭ 2018 года в стадах крупного рогатого скота молочных и мясных пород.

Во второй части [2] – особенностью «пробирочной» техники ТЭ и ее перспективами применения на российских стадах. Пробовали разобраться, почему возить племенной скот из-за рубежа пока проще и выгодней, чем размножать его внутри страны.

В этом разделе посмотрим на тенденции мировой и отечественной ТЭ мелкого рогатого скота и лощадей. Подведем общие итоги и определим место России в списке эмбрионально-продвинутых стран. Познакомимся с лауреатом АЕТЕ-2018.

Кони, овцы: русские разминаются

«За доцента!

Это тебе не мелочь

 по карманам тырить»

К/ф «Джентльмены удачи», 1971

Эмбриотрансфер России-2019 года разнообразили лошади и овцы [1]. А что в мире по ТЭ у этих животных?

Овцы. В Европе-2018 по этой позиции лидирует Англия: 505 вымываний, 3269 эмбрионов, 3247 пересадок свежими и 116 замороженно-оттаянными зародышами. 

За Великобританией следует Бразилия (618, 4808, 3906 и 902), Австралия (495, 2970, 2617 и 145) и Южная Африка (505, 3325, 2979 и 746 соответственно). Так что за эмбрионами племенных овец обращайтесь в эти страны. 

Швеция купила (вероятно, в той же Англии) и пересадила 365 оттаянных эмбрионов. А Испания и Бразилия испытали технику OPU на 39 и 11 овцах, получили in vitro 457 и 55 эмбрионов, пересадили 303 и 55 свежеполученных зародышей соответственно. До стадии эмбриона доходит каждый второй из собранных ооцитов овец (457 из 909), что является неплохим показателем в сравнении с коровьей техникой in vitro где до жизнеспособного эмбриона доходит каждый третий ооцит (1 018 163 из 3 558 339 в 2018 г).

 Кстати, Испания лидирует в ЕС еще и по производству «пробирочных» эмбрионов коз, правда до пересадки доходит каждый 11-й из собранных ооцитов (158 ТЭ из 1710 ооцитов).  

Среди этой мелкой рогатой суеты 2018 года русские разминаются «красеньким» - в ТЭ овец не замечены, хотя кое-какие красочные презентации по этой теме появлялись в ВИЖе [3].  Но уже в следующем 2019 году «Центр биотехнологий и ТЭ» из Московской области впервые в современной России выполнил 681 пересадку эмбрионов овец зарубежного происхождения и вероятно, с участием иностранных специалистов. Мы об этом прорыве писали в первой части обзора [1].

Лошади in vivo. Лидерство Европы-2018 (больше 100 вымываний лошадей) в традиционном эмбриосборе у Франция, Италия, Нидерланды, Португалия и Испания: 1315, 309, 281, 211 и 170 извлечений эмбрионов соотв. Русские в год собаки разминались на 26 кобылах-донорах, в прошлом году – вымыто 17 кобыл.

Кобылы, как известно не поддаются суперовуляции (почему бы этой проблемой не заняться российским доцентам с кандидатами?), поэтому сбор качественных эмбрионов составляет примерно 70% от заявленных суперовуляций. В мире-2018 зарегистрировано 33580 вымываний эмбрионов у лошадей, получено 23312 качественных зародышей. Почти все ТЭ выполнены свежими. Лишь специалисты США отважились на пересадку 591 заморожено-оттаянных зародыша. 

В США и Бразилия выполнено 1816 и 29157 вымываний у лошадей. Невероятно, но и здесь у бразильцев – мировое лидерство! Вот тебе и страна третьего мира (не устаю это повторять). 

Бразильский карнавал на лошадях

В нашей великой державы в прошлом году вымыто в 1715 раз (!) меньше кобыл-доноров, чем в развивающейся Бразилии. Невообразимое отставание по самому популярному на Руси четвероногому помощнику человека. Разминаемся…

Лошади in vitro. В мире-2018 выполнено 1714 пункций яичников. Оплодотворение 19879 ооцитов вне организма привели к формированию 2453 эмбриона (по 1,4 эмбриона на пункцию), большая часть которых произведена в Италии, Нидерландах и Бразилии (1431, 664 и 318 соотв.). Русские с лошадиной «пробиркой» даже не разминаются, не наш формат.

Прямо итало-бразильский карнавал мирового значения без участия российской эмбриологии. Это вам не «сколковскую» мелочь по карманам тырить, тут соображать надо.

У нас под боком, в Италии, есть свои кудесники лошадиной ТЭ in vitro в лице доктора Чезаре (фирма «Авантея»). Можно поехать и поучиться. Он первый в мире решился на массовую криоконсервацию 376 «пробирочных» эмбриона лошади и их экспорт в Нидерланды.

В Нидерландах в позапрошлом году выполнено 38 пересадок свежеполученных и 20 оттаянных эмбрионов и еще 273 пересадки импортных эмбрионов лошади (скорее всего тех самых, итальянских).

Статистика – дело тонкое

«Нас никому не сбить с пути

 - нам все равно, куда идти»

Михаил Жванецкий

Будем закругляться со статистикой эмбриотрансфера домашних животных в 2018-2019 гг. Хотя мы не уставали нахваливать Бразилию как мирового лидера в эмбриотрансфера коров и лошадей в первых двух частях, если на эту даму -  статистику ТЭ - взглянуть с точки зрения интенсивности использования пересадок эмбрионов на имеющемся поголовье, номинальные лидеры ТЭ будут выглядеть не так однозначно. 

Мы взялись посчитать пропорцию пересадок эмбрионов/поголовье для РФ и других стран, чтобы определить наше настоящее местоположение в европейской и мировой ТЭ, относительно имеющегося поголовья [4]. 

Статистика – дело тонкое. По этому показателю охвата репродуктивными технологиями национальных стад РФ опередила Бразилию, которую мы всегда ставили в пример как лидера по использованию ТЭ на производстве.

Согласно этой статистике охвата ТЭ (in vitro + in vivo) поголовья крупного рогатого скота Бразилия перемещается с первого на 11 место, сразу за Россией, а в истинные мировые лидеры эмбриотрансфера выходят Нидерланды – почти 10 пересадок на каждую 1000 голов скота.  В два раза больше, чем в США! Вот куда за опытом высоких технологий надо ехать по следам великого посольства Петра I спустя 300 лет.   

Рейтинг стран мира 2018 года по пересадкам эмбрионов in vitro + in vivo относительно поголовья крупного рогатого скота

* пересадки других лет, 

** только пересадки in vitro

Напомним, что Россия хотя и является четвертой страной в Европе-2018 по числу пересадок эмбрионов in vivo (12 378), ее место в мире относительно выполненных ТЭ на поголовье (ТЭ/n) – находится в конце первой десятки стран, а если взять предыдущий 2017 год (с бразильским участием)  - на седьмом месте (табл.). В прошлом 2019 году РФ переместилась уже в конец второй десятки из 41 страны, владеющих эмбриотрансфером. В общем, сегодня наш порядковый номер 20 на рукаве, середина на половину.

Тем не менее эти же цифры говорят о том, что в сравнении с другими 160 странами, не владеющими техникой ТЭ и даже с бывшими соседями по СССР (за исключение Эстонии и Украины) российские производители мяса и молока выглядят вполне респектабельно относительно использования современных тенденций воспроизводства коров (около 1 пересадки на 1000 коров). Спасибо специалистам и заказчикам эмбриотрансфера!

Надо добавить, что несколько стран (Парагвай, Панама, Уругвай и др., включая наши любимые Венесуэлу и Сербию) стали членами клуба ТЭ за счет использования исключительно эмбриологии in vitro, вероятно с участием зарубежных специалистов.

Еще раз приведем сводную таблицу производственных достижений отечественных эмбриологов в ТЭ-2019. Подробный отчет о выполненной работе приведен в 1 части обзора [1]. 

Разные новости из Нанты-2018

В заключении полистаем обзорную статью лауреата ТЭ-2018 Патриса Хамблота, представленную на собрании членов АЕТЕ во французской Нанте [5]. 

«Патрис окончил Национальную ветеринарную школу в Maisons Alfort (Париж) в 1978 году, особенно интересовался репродуктивной физиологией (… в основном, коров). …Никогда не забывает о главном смысле: сделать мир лучше и лучше ориентироваться на него, чем на яйцеклетку, сперму и эмбрион» (Представление П. Хамблота на премию АЕТЕ-2018). 

Что волнует лауреата, «присоединившегося к миру ИО в 1977 году», автора более 500 научных работ по ТЭ и репродуктивной физиологии коров?

Не в донора корм

«Страшный человек! 

Нельзя к нему спиной поворачиваться. 

Он может клизму в сонную артерию воткнуть!»

Т/с «Интерны», 2006 – 2010

Авторы отечественных учебных пособий и рекомендаций по ТЭ (часто - кабинетные эмбриологи) много внимания в своих трудах уделяют кормлению коров и телок. Расписывают рацион доноров и реципиентов вплоть до микроэлементов. На практике же вмешиваться в кормление лактирующих одноразовых доноров может обойтись «себе дороже». Их рацион отрегулирован на высокую молокоотдачу, и эмбриолог не вправе в эту технологию молокопроизводства вмешиваться. Да и в этом, как оказывается, нет нужды.  

По данным знакомого нам Патриса (Humblot P. et al., 1998), отрицательный энергетический баланс (NCE) и дефицит энергии в организме у телок и коров доноров (даже после отела) не сказывается на качестве суперовуляции (!). Гораздо опаснее их перекорм, особенно для постоянных нелактирующих доноров. Страшный человек – покушается на святое…

Высокие концентрации глюкозы и инсулина у коров с высоким индексом упитанности тела (BCS) способствуют росту фолликулов и качеству суперовуляции, но не способствуют оплодотворению и раннему выживанию эмбрионов. Также у коров-доноров с высоким уровнем BCS было увеличено количество неоплодотворенных ооцитов.

В опытах in vitro также отмечено увеличение неоплодотворенных яйцеклеток в сборе после суперовуляции таких доноров. Телки-доноры молочной породы, с высокой скоростью роста, имели высокий уровень инсулина в крови. У них после аспирации яйцеклеток (OPU) и их оплодотворения in vitro (IVF) отмечено замедленное образование и рост бластоцист, в сравнении с телками со средними значениями концентрации инсулина в крови (Freret et al., 2006).

И напротив, кратковременное искусственное увеличение энергии (и инсулина) в крови, за счет выпойки донорам пропиленгликоля, повышает супепровуляторный ответ и производство качественных эмбрионов (Gamarra et al., 2015), хотя механизм такого воздействия на индукцию суперовуляции остается не до конца понятен. Такие схемы с выпойкой энергетиков могут быть применены для животных доноров, у которых присутствует дефицит энергии в рационе, например новотельным коровам. Однако постоянное воздействие высокой энергии может отрицательно сказаться на оплодотворении и раннем эмбриональном развитии (Humblot et al., 2008; Garnsworthy et al., 2009).

А вас, анти-Мюллер, я попрошу остаться

 «Штирлиц! 

А вас я попрошу остаться» 

К/ф «Семнадцать мгновений весны», 1973

«Тебя как, сразу прикончить,

или желаешь помучиться?
- Лучше, конечно, помучиться»

К\ф «Белое солнце пустыни», 1970

Далее (стр. 11) Патрис в нескольких строках упоминает о возможности предсказания суперовуляторного ответа коров и телок доноров измерением анти-Мюллеровского гормона (Rico et al., 2009; Mossa et al. al., 2017). 

Позволим себе развить эту тему. Число «истинных» доноров в стаде коров и телок составляет 50-60%. При организации работы по ТЭ важной задачей эмбриолога является поиск и формирование из таких животных донорского стада.   Для того чтобы путем пробных 1-2-х суперовуляций сформировать стадо постоянных и даже одноразовых (лактирующих) доноров требуется примерно 4-6 месяцев. Женщины знают, что упорные и длительные ухаживания часто ломают барьеры первой невосприимчивости мужчины. И по нашим данным некоторые коровы начинают реагировать на суперовуляцию лишь с 3-4 попытки, то есть спустя 6-8 месяцев безрезультатного содержания на ферме [6]. Такого времени на проверку животных у эмбриологов нет, за исключением уникальных животных, с которыми было бы интересно «помучиться».  

Является заманчивым заранее подвергнуть кандидатов в доноры тестированию на способность реагировать полиовуляцию на гонадотропную обработку большим и желательно качественным эмбриосбором.

Предсказание реакции животного на суперовуляцию поможет улучшить эффективность технологий получения эмбрионов как in vitro, так и in vivo, так как позволяет заранее отказаться от животных с плохой реакцией на гормональную обработку. Тем более, что эмбриопродуктивность коров оказалась наследуемым признаком (см. ниже). 

 Для индивидуализации протокола суперовуляций Патрис Гумблот рекомендует использовать измерение анти-мюллеровского гормон (AMH), который поможет избежать «холостых» суперовуляций и составить список перспективных доноров. 

К сожалению, Патрис по этой теме ограничился несколькими строками. Вот что удалось еще узнать по анти-Мюллеру, также известному как ингибирующее вещество Мюллера (MIS). 

В организме женщины АМГ участвует в созревании фолликулов, а также их отборе для овуляции. Он синтезируется зернистыми клетками растущих фолликулов, подавляет рост соседних примордиальных фолликулов, а также уменьшает чувствительность растущих фолликулов к действию ФСГ. Все это способствует окончательному созреванию и овуляции одного фолликула каждый месяц. Так как синтез АМГ осуществляется растущими фолликулами, по его концентрации оценивают их количество. В свою очередь, количество растущих фолликулов отражает количество покоящихся примордиальных фолликулов, которые называют функциональным резервом яичников [7].

Оценка функционального резерва яичников женщин с помощью АМГ проводится при отборе и подготовке пациенток к программам экстракорпорального оплодотворения для лечения женского бесплодия. Пациентки с недостаточным функциональным резервом яичников и сниженным АМГ хуже отвечают на стимуляцию овуляции, и беременность у них наступает реже.

Для лиц женского пола значения АМГ <1 нг/мл свидетельствуют о снижении овариального резерва. Стоимость одного анализа составляет 1050 руб. 

А вот мнение того же Charlene Rico et al. (2012), изучавшего концентрацию АМГ у коров-доноров эмбрионов и ооцитов [8]. 

В настоящее время эмбриологам досаждает наличие значительных различий среди животных по эмбриопродуктивности и для технологий in vivo и in vitro остается заметным ограничителем в развитии эмбриональных биотехнологий.

     Было установлено, что способность коров доноров производить эмбрионы является повторяемым и наследуемым признаком при производстве эмбрионов вымыванием (Asada и Terawaki, 2002, Benyei и др., 2004, Eriksson и др.,2007, Monniax и др., 2010). Недавно это было обнаружено и для технологии получения эмбрионов in vitro (Merton и др., 2009).

Коровы, которые дали после гормональной обработки менее 15 крупных фолликулов в состоянии половой охоты (при  OPU in vitro) и  менее, чем 10 эмбрионов после обработки ФСГ (для in vivo) могут быть эффективно выявлены и отбракованы по концентрации АМГ в плазме крови: менее 87 и 74 пг/мл соответственно. 

Вроде бы все понятно - отбираем кровь и сортируем! Однако анти-Мюллер не так прост, как кажется. Наш коллега из Самарской области Денис Кнуров (ООО «Центр репродуктивных технологий») несколько лет изучает возможность предсказания уровня суперовуляции доноров по АМГ, но и он с уверенностью не может сказать должен ли анти-Мюллер остаться в арсенале эмбриологов. Его концентрация в крови коров в десять раз ниже, чем у женщин, поэтому тест системы должны быть более чувствительны. Лабораторий, готовых сотрудничать по этой теме в РФ по ИФА исследователь не нашел. Для долгосрочного прогноза возможностей супепровуляции АМГ оказался слишком капризным. Наличие АМГ в крови коровы и его концентрация оказались непостоянными величинами. Более того - если пробы долго хранить до момента исследования, то искажается концентрация гормона и что удивительно - иногда увеличивается за период хранения [8].  

Денис Кнуров: ну анти-Мюллер – погоди! Полтава-2011

И самое главное: текущая концентрация АМГ в крови или плазме предполагаемого донора не дают долгосрочного прогноза потенциала донора к массовому производству ооцитов, а лишь констатирует его предрасположенность к текущей полиовуляции. 

Подведем итог: такой Мюллер нам не нужен. Берусь предположить, что у всех особей женского пола потенциал премордиальных фолликулов примерно равный, но генетическая предрасположенность к их полиовуляции – назовем ее «эмбриональная щедрость» (ЭЩ) - может отличаться у «истинных» и гипофункциональных по суперовуляции доноров. Не исключено, что проявление ЭЩ может быть заложено на наследственном уровне (как процент двойневости) и со временем станет доступен для прогнозирования через генотипирование, как сегодня доступен генно-маркерный прогноз продуктивности по TPI.

И еще, коли АМГ тормозит рост и развитие других премордиальных фолликулов, делает их малочувствительными к ФСГ-воздействию, надо найти управу на анти-Мюллера в период проведения суперовуляции. Нейтрализовать его действие на этот период. Каким образом? Это информация для размышления. 

АЛТ, ВИЖ ты и банкет из 7 блюд

«Удача улыбается смелым…

А потом долго ржет над ними»

Михаил Жванецкий

Надо добавить, что еще 30 лет назад в госплемзаводе «Заря коммунизма» мы вместе с аспирантом ВИЖа Алексеем Бойко пытались предсказать уровень суперовуляции коров-доноров поиском подходящих биохимических индикаторов крови [9]. С этой целью по 22 позициям определяли концентрацию важнейших макро- микроэлементов, белков и активность некоторых ферментов у постоянных доноров лаборатории ТЭ (ферма Акулинино», Домодедовского района Московской области). Полученные результаты биохимии сыворотки крови сравнивали с итогами суперовуляции доноров. Исследование образцов крови проводили в лаборатории биохимии сельскохозяйственных животных ВИЖ на автоматическом анализаторе Sinchron СХ-5. Наиболее любопытные результаты были получены по ферменту аланинаминотрансферазе (АЛТ).    

Чем хорош этот фермент? По данным многих исследователей активность АЛТ в крови животных мало зависит от условий содержания и не изменяется в течение суток и на протяжении календарного года. Стабильность ферментативной активности АЛТ позволила провести подсчет средней эмбриональной продуктивности этих же доноров по сумме результатов предшествующих и последующих после взятия крови суперовуляций.

Средняя эмбриопродуктивность доноров с разным уровнем активности АЛТ

    *Р < 0.001

По нашим данным [6,9] у коров с низкой активностью АЛТ (11 —16 ИЕ/л) число желтых тел, общий сбор эмбрионов+яйцеклеток и выход полноценных зародышей оказались значительно ниже (р<0,001), чем у доноров с высокой активностью фермента (18—27 ИЕ/л). Граница активности АЛТ в пределах 16— 18 ИЕ/л позволяет с высокой достоверностью прогнозировать эмбриональную продуктивность коровы накануне суперовуляции и рассчитывать будущую ЭЩ донора.

PS. В завершение еще одно воспоминаний о лауреате премии АЕТЕ - настоящем французе: «На первую встречу во Франции английский контингент прибыл очень поздно (после полуночи из-за плохой погоды в Ла-Манше), но Патрис не волновался. Он отложил начало банкета из 7 блюд до нашего приезда, но я признаю, что он был удивлен количеством вина, выпитого собравшимися учеными…» [5]. Главное – не подать вида…

В четвертой части полистаем совместный сборник трудов специалистов бразильской и европейской (SBTE+АЕТЕ) ТЭ-2019.

Ссылки и библиография

1. https://www.dairynews.ru/news/transplantatsiya-embrionov-2019

2. https://www.dairynews.ru/news/transplantatsiya-embrionov-2019-2-probirka-ili-tra.html

3. https://www.vij.ru/meropriyatiya/s-uchastiem-sotrudnikov-vizha/s-uchastiem-sotrudnikov-vizha-2019

4. http://statinformation.ru/sel/skot.html

5. https://www.ruminantia.it/wp-content/uploads/2019/08/AETE-2018.pdf

6. Мадисон В.В., Мадисон Л.В., Бойко А.Г., Кучухидзе М.И. Отбор коров для донорства эмбрионов по тестированию крови // Зоотехния. - 1992. - №9-10. - С. 30-32

7. https://helix.ru/kb/item/08-093

8. http://dx.doi.org/10.1071/RD11290

9. Бойко А.Г., Мадисон В.В., Мадисон Л.В., Садыков Ш.М. Зависимость    результатов    суперовуляции    у    коров-доноров эмбрионов от уровня активности АЛТ плазмы крови // Доклады ВАСХНИЛ. —  1991. —  №8. — С.39-42.